วันอาทิตย์ที่ 23 มกราคม พ.ศ. 2554

PCR

เทคนิคพีซีอาร์ (PCR)  มีชื่อเต็มว่าเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส (Polymerase ChainReaction)  เป็นเทคนิคเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมคือดีเอ็นเอ  ให้มีปริมาณมากเป็นล้านเท่า ในระยะเวลาอันรวดเร็ว โดยอาศัยหลักการจำลองตัวของสายดีเอ็นเอ (DNA Replication) เลียนแบบกระบวนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิตตามธรรมชาติ ที่มีการสร้างสายดีเอ็นเอสายใหม่อีกหนึ่งสายจากดีเอ็นเอเดิม 


เทคนิคนี้พัฒนาขึ้นเมื่อปี 2528 โดยแกรี มุลลิส  (Kary B. Mullis) และคณะ แห่งบริษัทซีตัส (Cetus Corporation) สหรัฐอเมริกา ทำให้ให้เขาได้รับรางวัลโนเบลในปี 2537 ปัจจุบันเทคนิคพีซีอาร์ได้รับการปรับปรุงและพัฒนาจนประยุกต์ใช้ได้ในหลายด้าน และได้รับการยอมรับว่าเป็นเทคโนโลยีที่สำคัญมากต่องานวิจัยด้านเทคโนโลยีชีวภาพ


    ที่มาภาพ :       (ซ้าย)  http://photosynthesis.com/images-titles/P339-98.jpeg
                  (ขวา) http://edge.org/documents/archive/edge177.html


: : หลักการทำงานของเทคนิคพีซีอาร์ 

เทคนิคนี้ใช้หลักการพื้นฐานในการเพิ่มดีเอ็นเอด้วยการจำลองดีเอ็นเอสายใหม่จากสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบหนึ่งสาย ด้วยเอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส (DNA polymerase)  โดยใช้ดีเอ็นเอเริ่มต้นหรือไพรเมอร์ (Primer) 1 คู่ ทำให้สังเคราะห์ดีเอ็นเอได้คราวละ 2 สายพร้อมกัน ประกอบด้วยปฏิกิริยาสำคัญ 3 ขั้นตอน และหมุนเวียนต่อเนื่องกันไป ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมของแต่ละขั้นตอน


           : : ขั้นแรก เรียกว่า Denaturation เป็นการแยกสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจากสภาพที่เป็นเส้นคู่ให้เป็นเส้นเดี่ยวโดยใช้อุณหภูมิในช่วง 92-95 องศาเซลเซียส

           : : ขั้นที่สอง เรียกว่า Annealing เป็นขั้นตอนที่ลดอุณหภูมิลงอยู่ในช่วง 50-60 องศาเซลเซียส และใช้ไพรเมอร์ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายสั้น ๆ (ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์จำนวน 17-24 เบส) ที่มีลำดับเบสเป็นเข้าคู่กับสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจับคู่กัน

           : : ขั้นที่สาม เรียกว่า Extension หรือ Synthesis of new DNA  ซึ่งเป็นขั้นตอนการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่โดยสังเคราะห์ต่อจากส่วนปลายของไพรเมอร์ (ที่ใส่เข้าไปในขั้นที่สอง) ตามข้อมูลบนดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบแต่ละสายโดยอาศัยการทำงานของเอ็นไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ซึ่งเอนไซม์นี้ทำงานได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิ 72-75 องศาเซลเซียส

จากขั้นตอนที่ 1-3 ซึ่งนับเป็นจำนวน 1 รอบ (One cycle) ให้ผลผลิตเป็นดีเอ็นเอสายคู่ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สม (หรือเข้ากัน) กับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบ เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า และเมื่อจัดให้เกิดปฏิกิริยาลูกโซ่จากขั้นที่ 1 ถึง 3 หมุนเวียนไปอีกหลาย ๆ รอบ จะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้จำนวนมาก ประมาณว่าปฏิกิริยา 30 - 40 รอบ สามารถเพิ่มปริมาณสารดีเอ็นเอได้ไม่น้อยกว่าพันล้านเท่า  ดังนั้น แม้ตัวอย่างที่นำมาศึกษามีปริมาณสารพันธุกรรมน้อยมาก เราก็ใช้เทคนิคพีซีอาร์เพิ่มจำนวนได้หลายเท่าทวีคูณ


Melecular photocopy

นักวิทยาศาสตร์ขนานนามเทคนิคพีซีอาร์ว่า "เทคนิคการถ่ายสำเนาโมเลกุล"

ที่มาภาพ : http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html


ดีเอ็นเอที่เกิดจากเทคนิคนี้ในหลอดทลอง มองไม่เห็นด้วยตาเปล่า  ดังนั้นเพื่อตรวจหาดีเอ็นเอผลผลิต ต้องนำตัวอย่างที่ทำพีซีอาร์มแยกหาดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคที่เรียกว่าอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟริสิส (Agarose gel electrophoresis) ซึ่งเป็นการแยกดีเอ็นเอด้วยกระแสไฟฟ้าบนแผ่นวุ้น (Agarose gel) โดยระยะทางที่ดีเอ็นเอเคลื่อนที่ไปได้ขึ้นกับขนาดของดีเอ็นเอและกระแสไฟฟ้าที่ใช้ ดีเอ็นเอที่แยกโดยวิธีนี้ มองเห็นได้เมื่อย้อมด้วยสีพิเศษ ซึ่งเรืองแสงภายใต้แสงอุลตร้าไวโอเลต 


: : พีซีอาร์มีประโยชน์อย่างไรบ้าง?

เทคนิคพีซีอาร์ ถือเป็นเทคนิคสำคัญในงานวิจัยทางเทคโนโลยีชีวภาพ ทั้งงานพื้นฐานในห้องปฏิบัติการ ไปจนถึงการประยุกต์ใช้ในด้านต่างๆ เช่น ด้านการแพทย์  และด้านการเกษตร


ตัวอย่างประโยชน์ด้านการแพทย์

ใช้ในการวินิจฉัยโรคต่าง ๆ ทั้งโรคติดเชื้อและโรคจากพันธุกรรม ได้แก่ การตรวจหาเชื้อไวรัสหรือแบคทีเรียที่เป็นสาเหตุของโรค เช่น เอดส์, วัณโรค, มาลาเรีย   แม้มีเชื้อโรคในตัวอย่างที่ส่งมาตรวจจำนวนน้อย ทำให้การวินิจฉัยโรคเพื่อป้องกันและรักษาเป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพมากยิ่งขึ้น และใช้เวลาน้อยลง

ปัจจุบันมีการพัฒนาเทคนิคพีซีอาร์ให้มีประสิทธิภาพมากขึ้น ลดขั้นตอนยุ่งยากต่างๆ ที่เสี่ยงต่อการปนเปื้อน  และนอกจากยืนยันว่าเป็นโรคนั้นๆ ด้วยความไวและความจำเพาะสูงแล้ว ยังบอกความรุนแรงของโรคได้ด้วย 


PRC & Bird Flu

ที่มาภาพ : ผลงานวิจัยของ ศ.นพ. ยง  ภู่วรวรรณ และคณะจากคณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์
                มหาวิทยาลัย ที่ได้รับการสนับสนุนจากศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ




เปรียบเทียบการวินิจฉัยโรคไข้หวัดนกโดยวิธีเพาะเชื้อ และเครื่องพีซีอาร์



วิธีตรวจสอบ

เวลาที่ใช้ตรวจสอบ

ความจำเพาะ

- ใช้วิธีตรวจวินิจฉัยโดยการเพาะเชื้อในไข่ไก่

5-10 วัน

100%

- ใช้ชุดตรวจที่ใช้กับเครื่องพีซีอาร์

1 วัน

100%

- ใช้ชุดตรวจที่ใช้กับเครื่องพีซีอาร์(แบบเรียลไทม์)

1-3 ชั่วโมง

100%


ในต่างประเทศ นักวิทยาศาสตร์ได้พัฒนาเทคนิคพีซีอาร์เพื่อตรวจหาเชื้อแอนแทรกซ์ ซึ่งเป็นเชื้อโรคที่ใช้ผลิตอาวุธชีวภาพ


ตัวอย่างประโยชน์ด้านการเกษตร
มีประโยชน์ต่อการตรวจวินิจฉัยโรคพืช การตรวจสอบสายพันธุ์พืช  นอกจากนี้แล้วเทคนิคพีซีอาร์ ยังช่วยให้เข้าใจพันธุกรรมของเชื้อโรคพืช ตลอดจนการนำไปใช้ในการป้องกันกำจัดโรคพืชที่เกิดจากเชื้อรา แบคทีเรีย และไวรัส หรือเชื้อสาเหตุโรคอื่น ๆ

นำมาใช้ในอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงกุ้ง ซึ่งเป็นอุตสาหกรรมส่งออกที่ทำรายได้ให้กับประเทศจำนวนมาก โดยใช้เทคนิคนี้ตรวจหาเชื้อสาเหตุโรคในกุ้ง เช่น เชื้อไวรัส ช่วยป้องกันการแพร่ระบาดของโรคได้ทันท่วงที นอกจากนี้ยังนำมาประยุกต์ใช้ในการคัดเลือกสายพันธุ์กุ้งที่ดีเพื่อใช้ในการผสมพันธุ์ซึ่งมีความแปรปรวนพันธุกรรม (Genetic Diversity หรือ Variation) สูง


การตรวจไวรัสสาเหตุโรคกุ้งด้วยเทคนิคพีซีอาร์

ที่มาภาพ : หน่วยวิจัยเพื่อความเป็นเลิศเทคโนโลยีชีวภาพกุ้ง

ตัวอย่างประโยชน์ด้านการศึกษาจีโนม
มีประโยชน์ในการศึกษาความผันแปรหรือกลายพันธุ์ของยีน การทำแผนที่ยีน และการศึกษาลำดับเบสของสิ่งมีชีวิต นำไปใช้ประโยชน์ได้ทั้งในงานวิจัยทางชีววิทยาโมเลกุลและพันธุวิศวกรรม เช่น การวิเคราะห์ลำดับเบสของยีน (Gene sequencing) การสร้างดีเอ็นเอตรวจติดตาม (DNA probe) และการวิจัยอื่นๆ

โครงการระดับนานาชาติ เช่น โครงการศึกษาจีโนมมนุษย์ (Human Genome Project) ก็ใช้เทคนิคพีซีอาร์สืบหาตำแหน่งยีนแต่ละยีนของมนุษย์



Tad Sonstegard นักพันธุศาสตร์ จากหน่วยบริการทางการเกษตร (Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture) ระหว่างศึกษาจีโนมพืชโดยใช้เทคนิคพีซีอาร์ ในขั้นตอนหนึ่งของการวิเคราะห์ลำดับเบส

ที่มาภาพ :
http//:www.ars.usda.gov/is/graphics/photos/jul00/k8926-1i.jpg
              


สมาชิก
กัณฑ์ศิษฏ์ฏา กิจวรรณ
สุทธิมา เจริญสวัสดิ์
รัตนพร ภัทราคร

ไม่มีความคิดเห็น:

แสดงความคิดเห็น